加州大学旧金山分校和纽约大学的Johannes Morstein及合作者日前在JACS（DOI: 10.1021/jacs.2c07833）上发表了他们在脂质小分子在穿越细胞膜领域的研究。论文中对于脂肪链长度对脂化小分子膜通透性的影响以及生物活性做了系统研究。
为了在膜或细胞内发挥作用，小分子需要通过主动或被动运输进入或穿过生物膜。在某种程度上，分子水溶性与膜通透性是相互对抗的。天然化合物通常利用脂化的方式调节其药代动力学和药效学特性。众所周知的例子包括苔藓植物素、毒胡萝卜素、达托霉素和佛波酯。有脂质结构的高生物活性药物的例子包括芬戈莫德（FTY720）、eliglustat、palmostatin
B、沙美特罗和奥利司他（图1）。
图1.
天然脂化小分子（上）包含脂质结构的药物分子（下）。（图片来源：J. Am. Chem. Soc.）
系统性脂质/小分子结合的研究尚不深入。这篇文章主要通过化学信息学分析脂化天然产物，以此启发脂化小分子药物的设计。
脂肪酸通常分为碳数小于等于5的短链脂肪酸（SCFA, short-chain fatty acid），6−12个碳的中链脂肪酸（MCFA, medium-chain fatty acid），13-21个碳的长链脂肪酸（LCFA, long-chain fatty acid） ，以及超过21个碳的超长链脂肪酸（VLCFA, very long chain fatty acid）。作者在本文中着重对于SCFA、MCFA和LCFA脂肪酸与小分子形成的天然加成物进行剖析。脂化的大分子，例如核酸与多肽，不在本文的讨论范文内。
作者首先利用Collection of Open Natural Products（COCONUT）数据库提供的脂化天然小分子信息（图2A），分析了脂链长度（图2B-D）、氢键受体计数（HAC）（图2E）、连接官能团（图2F，G）和不饱和度（图2H，I）这四个参数。研究者发现，脂肪链在不同来源的天然产物（动物、细菌、真菌和植物）中表现出相似的长度分布，它们通常比化学修饰蛋白质的脂肪链短小。数据分析同时表明，脂肪链的长短与连接官能团（酰胺、酯、醚、仲胺）并没有显著关联。不饱和脂肪链并不罕见，但大多数脂质链是饱和的。分析数据显示，饱和中脂肪链在天然产物中占主导地位，或许这类脂质修饰最能够获得新的生物活性小分子药物。
图2（图片来源：J.
Am. Chem. Soc.）
在数据分析的指导下，作者合成了一系列脂化荧光素硫脲加合物（图3A），以研究它们的细胞摄取（荧光素固有的细胞渗透性很差，常被用于研究化学修饰影响细胞摄取的底物）。作者通过活细胞荧光成像在HeLa细胞中评估了脂化荧光素衍生物的细胞摄取（图3B）。在用各自的脂质-荧光素偶联物处理活细胞 15 分钟后，细胞内荧光存在很大差异（图3C，D）。
图3（图片来源：J.
Am. Chem. Soc.）
短脂肪化合物1（C2）和中脂肪化合物2（C6）的细胞摄取很弱，而具有较长脂肪链的3 （C10）、4 （C14）和5 （C18） 则表现出了>100 倍的细胞荧光增加。数据表明，与质膜的结合能力取决于脂质的化学结构，而不仅仅是其分子量或整体亲脂性。其他脂质结构也能够显著促进细胞摄取（例如，6、8、9和12），而高度结构刚性的脂质类型（7和11，包括甾醇衍生结构）似乎无法介导快速质膜结合或细胞摄取。
作者接下来扩展了荧光化合物底物，罗丹明衍生物有良好的细胞通透性和细胞快速积累，因此被作者选为荧光化合物底物做扩展研究。四个脂质-罗丹明加合物 （图4A）通过罗丹明 B 异硫氰酸酯 （RITC）和氨基脂质偶联制备。
图4（图片来源：J.
Am. Chem. Soc.）
作者对比了一种短脂肪链偶联物（C2-Rho），一种中脂肪链偶联物（C10-Rho）和两个长脂肪链偶联物 （C14-Rho和C18-Rho）。C2-Rho和C10-Rho表现出良好的细胞摄取（图 4B，C）。相比之下，C14-Rho和C18-Rho则表现出显著降低的细胞摄取，这表明长脂肪链修饰降低了罗丹明的生物利用度。
为了测试中脂肪链偶联物的快速吸收是否遵循主动或被动传输机制，作者使用了一系列主动运输抑制剂与C10-Rho结合分析，证明这些脂化荧光分子的细胞摄取可能是通过溶质载体（SLC）介导的或是被动扩散
（图 4D）。对于长脂肪偶合物C14-Rho和C18-Rho的低细胞吸收，作者提出假说，认为其可能具有更高的形成聚集体的倾向，这也可能干扰它们膜分配的能力，进一步限制其生物利用度。动态光散射分析证实了C18-Rho相较于其它类似物具有较低的聚集浓度临界值（图4E），因而有更强的聚集倾向。
接下来，作者使用了另一种广泛用于活细胞的荧光团成像的化合物硝基苯并恶二唑（NBD）。NBDs常用于开发荧光脂质，并被认为具有一定的膜渗透度。作者通过4-chloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole与脂质氨基化合物的亲核芳族取代反应（SNAr）制备了脂化NBD系列化合物，包含不同长度脂化基团的C2（C2-NBD）、C10（C10-NBD）、C14（C14-NBD）和 C18 （C18-NBD）化合物（图 4F）。结果显示，只有中脂肪链偶联物C10-NBD实现了HeLa细胞中的有效积累（图 4G，H）。C14-NBD的细胞摄取度大大降低，而C2-NBD和C18-NBD则没有表现出可测的细胞摄取。C2-NBD的低数值可能是因为较低的细胞保留，而不是较低的细胞摄取导致的。作者通过试验验证了这个假说，并凸显了中脂肪链偶联的另一个优势，即通过脂质基团与蛋白与膜的作用而增加分子的细胞保留能力，这一点与实验中发现的C10-NBD细胞摄取不受主动细胞转运抑制剂影响相吻合 （图4K）。
药效团-脂质偶联物的细胞摄取和生物活性
图5（图片来源：J.
Am. Chem. Soc.）
在利用荧光团探索了脂质对于小分子细胞摄取的影响后，作者接下来将重点转向了具有生物活性的小分子潜在药物上。紫杉醇及其衍生物是微管稳定分子，已被批准用于治疗各种类型的癌症，延长紫杉醇类似物在细胞中的持久积累是药物研发的一个热门内容。在这篇文章中，作者研究了将多西紫杉醇（DTX）脂化（图5A）对于增加其生物利用度的影响。作者合成了多西紫杉醇C5（C5-DTX）、C11（C11-DTX）和C18（C18-DTX）衍生物，其末端还有一个炔基。引入这个炔基的目的是，通过铜催化的叠氮化物-炔烃衍生物的环加成反应（CuAAC，Click
chemistry）间接检测多西紫杉醇偶联物的存在（图 5B）。
作者发现C11-DTX的细胞荧光强于C18-DTX，这与此前的发现一致，即长链脂肪会阻碍小分子的膜通透性。C5-DTX 的低荧光可能是由于 C5-DTX-荧光团的细胞保留较少的缘故。为了比较脂质-DTX偶联物的生物活性，作者在两种不同的癌细胞中（HeLa和MCF7 细胞）进行细胞活力实验（图5C）。C11-DTX 在所有三种偶联物中表现出最大的细胞毒性，而 C5-DTX 表现出轻微降低的细胞毒性，而C18-DTX的毒性则明显降低。然而，C11-DTX相对于未脂化的DTX分子来说生物活性更低。
作者接下来探索了靶向膜蛋白的分子。季铵基钠通道阻滞剂QX222和QX314 常用于神经科学，并且它们都缺乏细胞渗透性。作者合成了一系列的QX类似物，包括没有脂质结构的C0-QX，中链脂肪偶联物C10-QX和长链脂肪偶联物C16-QX（图5D），在表达Nav1.7 通道的NG 108.15细胞中测试了这一系列的化合物。实验者记录了膜片钳模式下整个细胞中的电流强度，只有在中链脂肪偶联物C10-QX的情况下测量到了外部Na+电流阻滞（图5E）。这表明中链脂肪偶联物C10-QX通过透膜而实现了其生物活性。
小分子如何与生物膜相互作用对它们的生物活性至关重要。在天然产物中，生物活性分子通常与脂质基团结合来实现与膜的作用。本文系统描述了天然产物中存在的脂质基团类型。系统的荧光团和生物活性小分子的合成脂化分子展示了渗透性、滞留性和小分子的生物活性。研究发现，饱和的中等长度脂质能更有效地促进细胞积累和生物活性，尤其是对那些膜通透性差的小分子来说。在许多情况下，长链脂肪被发现表现出相反的效果，并阻碍细胞吸收和分子的生物活性。自然界倾向于选择中等长度的脂质修饰。
Medium-Chain
Lipid Conjugation Facilitates Cell-Permeability and Bioactivity
Johannes
Morstein,* Alice Capecchi, Konstantin Hinnah, ByungUk Park, Jerome
Petit-Jacques, Reid C. Van Lehn, Jean-Louis Reymond, and Dirk TraunerJ. Am. Chem. Soc. DOI: 10.1021/jacs.2c07833
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